凱氏定氮法測定飼料中蛋白氮的含量
1 前言
飼料作為畜牧養殖生產中的重要生產資料，其營養價值的高低直接影響到畜牧養殖的效益，而飼料中蛋白質的含量是一項重要的指標，飼料中粗蛋白質包括蛋白氮和非蛋白氮兩部分，后者主要包括硝酸鹽、銨鹽等，故不能反映出飼料蛋白質對動物的真正營養價值。有些不法生產商故意添加硫酸銨、尿素等非蛋白質來提高產品的粗蛋白含量，導致部分養殖場戶存在一個誤區，認為標簽上標注的粗蛋白質高，營養價值就高，從而造成養殖效益的低下。本文在凱氏定氮方法的基礎上進行相應的前處理從而達到測定真蛋白的目的。
蛋白質經沸水提取并在一定堿性條件下，能與硫酸銅發生鹽析作用而析出沉淀，此沉淀物不溶于熱水，而非蛋白氮則易溶于水，用熱水洗沉淀，將水溶性含氮物洗去，剩下的沉淀物再用凱氏定氮法測定，得出真蛋白質的含量。
2 實驗部分
2.1 儀器與試劑
粉碎機、40目分樣篩、分析天平（感量0.1mg）、燒杯250ml、玻璃棒、漏斗(直徑10cm)、定性濾紙（中速，12.5cm，15cm)、可控溫干燥箱、K1100F全自動凱氏定氮儀、SH420F石墨消解爐、可控溫電爐
濃硫酸（98%）、硫酸銅(分析純)、硫酸銅溶液(10%)、硫酸鉀、氫氧化鈉溶液（40%）、氫氧化鈉溶液（2.5%）、硼酸（20g/L，按混合指示劑：硼酸=1:100加入指示劑）、甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑(1:5)、硫酸標準溶液（C（1/2H2SO4=0.1011mol/L)、氯化鋇溶液（5%）
2.2 實驗方法
2.2.1 前處理
將風干飼料樣品用飼料樣品粉碎機粉碎，通過40目（孔徑0.45 mm）篩，制得分析飼料樣本，備用。
準確稱取約0.5g試樣（精確至0.000 1 g）置于250 mL燒杯中，加75mL蒸餾水，加熱至沸煮沸30min，加入2.5 %氫氧化鈉溶液20 mL，10 %硫酸銅溶液20 mL，用玻璃棒充分攪拌均勻，微沸一段時間，冷卻放置超過2 h。用定性濾紙過濾，然后用70~80 ℃熱水沖洗沉淀5次以上，用 5%氯化鋇溶液5滴和數滴鹽酸檢查濾液，直至不生成白色硫酸鋇沉淀。將沉淀和濾紙放在65 ℃烘箱烘干。（共稱取9個樣品，4-9經上述沉淀處理，8號樣品添加0.0636g尿素，9號樣品添加0.1135g硫酸銨；1-3號樣品不做沉淀處理直接消化）
2.2.2 消解
將干燥后的沉淀連同濾紙一起放入消化管中，加入15mL濃硫酸，3g硫酸鉀，0.2g硫酸銅，放在石墨消解爐上設置溫度梯度升溫消化（同時做空白試驗）。
升溫程序：
消解完成后，冷卻，待上機。
2.2.3 測試
將冷卻后的消化管置于K1100F全自動凱氏定氮儀上，設置參數：硼酸20mL，堿 60mL，稀釋水10mL，蒸餾5min。依次做空白及樣品，結果自動計算，打印。
3 結果與討論
3.1 樣品空白消耗滴定酸的體積
3.4 飼料中添加蛋白氮測定
通過3.2與3.3的數據對比可以看出兩者相差近2%，除去操作損失基本可以判斷飼料中確實含有非蛋白氮成分。8號和9號樣品分別添加一定量的尿素、硫酸銨，但是真蛋白含量與其他樣相差不大，所以可以驗證此方法測定飼料中真蛋白的可行性。
3.4 結論
通過硫酸銅等重金屬鹽在堿性環境下是蛋白質變性，過濾掉非蛋白氮成分，再利用凱氏定氮法測定蛋白質含量，操作并不復雜，且結果令人滿意，通過添加非蛋白氮（尿素、硫酸銨）成分驗證了此方法的適用性，可以用于實際的真蛋白檢測中。
注意事項
傾瀉法過濾洗滌時，燒杯中的沉淀物一定要徹底清洗。且洗滌時要用80℃左右的熱水，可以減少洗滌次數。沉淀必須要烘干，不可帶有大量水分放入消化管消化，否則會過沖，造成實驗失敗。在石墨爐上消化時，應設置梯度升溫，避免樣品直接高溫出現過沖現象。